1、連續劃線法步驟：從平板邊緣一點開始，連續作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當中不需灼燒接種環上的菌。

2、接種環于酒精燈外焰燒至紅透，接種棒也要充分灼燒，最后再集中燒接種環至紅。

(資料圖片)

3、輕輕搖勻待接種試管，左手手心托待接種試管底側部，右手執接種環，右手小指拔下試管塞，于酒精燈附近將接種環伸進試管，稍候，再插入待接接種液中，蘸一下，取滿一環，抽出、燒塞、蓋蓋、放回試管架。

4、或將接種環通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環冷卻，然后以無菌操作接種環直接取平板上待分離純化的菌落。

5、2、靠近酒精燈處打開平皿蓋約30°，右手將環伸進平皿，將菌種點種在平板邊緣一處，輕輕涂布于瓊脂培養基邊緣，抽出接種環，蓋上平皿蓋，然后將接種環上多余的培養液在火焰中灼燒，打開平皿蓋約30°伸入接種環。

6、3、待接種環冷卻后，再與接種液處輕輕接觸，開始在平板表面輕巧滑動劃線，接種環不要嵌入培養基內劃破培養基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊，劃線完畢，關上皿蓋。

7、灼燒接種環，待冷卻后放置接種架上。

8、培養皿倒置于適溫的恒溫箱內培養（以免培養過程皿蓋冷凝水滴下，沖散已分離的菌落）。

9、培養后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態，鏡檢后再接種斜面。

10、劃線分離主要有分區劃線法和連續劃線法兩種。

11、分區劃線法分離時平板分四個區，故又稱四分區劃線法。

12、劃線時每次將平板轉動60~70°劃線，每換一次角度，應將接種環上的菌燒死后，再通過上次劃線處劃線。

13、其中第4區是單菌落的主要分布區，故其劃線面積應最大。

14、為防止第4區內劃線與2、3區線條相接觸，應使4區線條與1區線條相平行，這樣區與區間線條夾角最好保持120°左右。

15、先將接種環沾取少量菌在平板1區劃3~5條平行線，取出接種環，左手關上皿蓋，將平板轉動60~70°，右手把接種環上多余菌體燒死，將燒紅的接種環在平板邊緣冷卻，再按以上方法以1區劃線的菌體為菌源，由1區向2區作第2次平行劃線。

16、2、第2次劃線完畢，同時再把平皿轉動約60~70°，同樣依次在3、4區劃線。

17、劃線完畢，灼燒接種環，關上皿蓋，同上法培養，在劃線區觀察單菌落。

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